+86 13683842418
+86 13683842418
河南省洛阳市洛阳国家大学科技园
目前国内很多的实验室在分离DNA时（如PCR产物），依然使用传统的切胶回收方法，该方法耗时长、成本高。今天我们在这里介绍另一种DNA分离纯化方法——磁珠分离法，该方法我们最初从美国得克萨斯大学阿灵顿分校的徐森助理教授处得知（https://blog.uta.edu/xus/sen-xu/）。实际上，很多DNA提取或组学建库试剂盒普遍采用这种方法来分离不同大小的DNA。
磁珠法是一种固相载体可逆化固定（SPRI）的分离纯化方法，主要原理为：在不同浓度的PEG（polyethylene glycol；聚乙二醇）中，会有不同片段大小的DNA吸附在磁珠的羧基修饰层上，这些DNA可以再溶解在水中，以此来洗脱回收。
实验使用的磁珠分为五层（图1；直径1微米），由内而外依次为：聚苯乙烯材料的核心、超顺磁材料（主要为四氧化三铁）、第二层聚苯乙烯材料、第二层超顺磁材料以及表面粗糙的羧基修饰层。粗糙的表面更利于核酸与羧基修饰层结合。
图1.磁珠各层成分
（图片改自参考文献1）
在整个体系中，PEG的浓度是影响DNA回收的决定性因素（其他因素还包括DNA大小和浓度、盐离子浓度、作用时间等等）。DNA在一定浓度的PEG存在条件下，NaCl或MgCl2促进下，使DNA发生脱水反应，分子构象会发生急剧变化，由线状被压缩形成卷曲球状，继而聚集沉淀，同时随PEG分子量、浓度以及盐浓度的不同，不同长度的DNA可以被选择性的沉淀出来。在磁珠体系中，特定分子量（常用的是PEG8000）的PEG的功能主要是与盐离子共同作用，改变不同长度DNA的分子构象，同时增加体系的粘稠程度，使磁珠在其中处于悬浮状态，不易沉降，增加磁珠在空间位置的碰撞与排斥，从而增加核酸与磁珠的聚集效率与效果，除此之外，PEG与蛋白质具有相容性，也可去除样品中的蛋白质。
当前主流观点认为，处于PEG和盐离子环境中的DNA，因脱水作用而发生分子构象改变后，会暴露出磷酸骨架上大量的带负电荷的磷酸基团，与表面带负电荷的羧基磁珠结合。负负电荷之间的作用是由于带正电荷的盐离子的作用（如Na+；图2）。带负电的磷酸基团借由解离的盐离子（如Na+）与羧基形成离子桥，使DNA被特异性吸附到羧基磁珠表面。当PEG和盐类被去除之后，加入水性分子，会快速充分水化DNA，解除其三者之间的离子相互作用，使得吸附到磁珠的DNA被纯化出来。
操作的具体步骤如下图3（0.6x代表DNA溶液体积的0.6倍；该倍数要依据各自不同的实验体系自行检测调整）：
图3.磁珠法分离400-600bp DNA片断的步骤
（图片改自国产厂家说明图）
如果只是分离纯化单条带PCR产物，我们通常使用1.2x的磁珠，与PCR产物在EP管内混合后放在磁力架上1分钟，丢弃上清，70%酒精洗涤两次后室温干燥，然后将EP管从磁力架上取下，TE或者纯水与磁珠混合，然后放回磁力架取上清，整个过程耗时约15分钟。
要提一下的是,我们以前常用的是Beckman Coulter产的Agencourt AMPure XP磁珠，我们自家生产的筛选磁珠，试用效果与前者相当，但其价格只有AMPure的约1/5（吐槽下：产品很好用，但里面的说明书图片都模糊不清，实验细节也令人费解，望厂家能处理下这些细节；我们在此将其产品说明图清晰化以方便读者阅读）;过几天我们还会有实验室内配置磁珠的方法,该方法可以更大幅的降低试剂成本,希望能够成为常做组学文库或者DNA提取实验室的省钱利器。
磁珠DNA分离法中多次使用了磁力架，来使磁珠聚合并方便除去洗脱液。一般进口磁力架（针对EP管或者96孔PCR板）约1000-5000人民币，而我们实验室（中国海洋大学海洋生物多样性与进化研究所-进化基因组学研究室）能够通过３D打印机自行打印并使用了稀土材料制作的高强永磁铁，效果甚至好于商业化产品。具体制作方法我们会在之后的推送中介绍。