荧光定量PCR常见问题解答
Source:狄光辉Author:admin Addtime:2024/04/07 Click:
荧光定量PCR异常扩增曲线常见问题
qPCR虽然简单，但是难免会出现一些小问题，接下来就谈谈可能会出现哪些问题，以及这些问题该如何解决：
1. 检测荧光信号的设置步骤有误，一般来说荧光信号收集在延伸步骤；
2. 引物或探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
3. 模板量不足：对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起；
4. 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况；
1. 扩增效率低: 反应条件不够优化，设计更好的引物或探针，改用三步法进行反应，适当降低退火温度，增加镁离子浓度等；
3. PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度；
2. 标准品出现降解：应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品；
1. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；
2. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；
3. 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒；
1. 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现；
2. 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比；
3. 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的试剂盒；
4. 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入；
2. 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法；
3.反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响；
8.怎样判断定量pcr仪的样本加热块是否被污染？怎样清除污染？
1. 一个办法是运行背景校正反应板，当一个或多个反应孔连续显示出不正常的高信号，则表明该孔可能被荧光污染物；
2. 另外一种办法是在不放任何物品到样本块上的前提下，当某个孔的信号明显高出其他孔时，则表明该孔被污染；
内标的优点在于目标基因与管家基因的反应条件最接近一致，缺点在于目标基因与管家基因的引物和探针相互之间会发生竞争与抑制，导致它们的PCR效率有差异。
外标的优点在于目标基因与管家基因的引物和探针之间没有发生竞争与抑制的机会，但是不同管之间的反应条件差异比同管的要大，也会导致它们的PCR效率有差异。
荧光定量PCR异常扩增曲线案例分析攻略
请对照试剂盒说明书，检查时间、温度、循环数、荧光采集等是否设置正确。如需进行ROX校正的，需要看下所选用的试剂中是否含有ROX来作为参比荧光染料。目前市面上主流荧光定量PCR仪器都不需要ROX来校正，如需进行ROX校正的，需要确保试剂Mix里面含有ROX染料。
经常有一些结果，很明显的阴性样本，但是扩增图谱的扩增曲线抬升了，这样就会与阈值线相交，有了CT值。
如图：基线自动扣除错误，导致扩增曲线异常
这是由于软件在进行基线自动扣除的时候出现错误，引起了扩增曲线抬升。出现这种情况可以采取手动调整基线的方法，重新定义基线即可正常，即将基线起点改为荧光信号稳定的循环数（一般是3），基线终点要改成扩增曲线起峰的前一个循环数（比如起峰是在第21个循环，那基线的终点就是20）。
引起这样的原因是由于选用的耗材、试剂或者操作的原因导致背景荧光信号有所波动，从而造成反应孔的自动基线扣除错误。
